明治12年（1879年）7月にコレラの蔓延防止のために神奈川県地方検疫局が設置され、同年9月に三浦郡長浦（現在の横須賀市長浦）に設けられた「長浦消毒所」が、横浜検疫所のはじまりです。現在の場所（横浜市金沢区長浜）に移転したのは明治28年（1885年）、その際に名称も「長濱検疫所」とされました。

明治32年（1899年）4月、「海港検疫法」の公布に伴い「横浜海港検疫所」と改名。同年5月に北里柴三郎の伝染病研究所の研究助手だった野口英世（当時22歳）が、同所に海港検疫医官補として勤務をはじめました。
入所すぐの6月、野口英世は横浜港に入港しようとしていた「亜米利加丸」の乗員から、検疫所初ともなるペスト患者発見、隔離という成果をあげました。

野口英世が検疫所に勤務した期間は明治32年（1899年）5月から9月までのわずか5ヶ月間でしたが、その功績から、師である北里柴三郎からの推薦を受けて、当時ペストの流行が盛んであった清国・牛荘（ニューチャン）に国際予防委員会の一員として派遣されることとなったのです。

翌明治33年（1900年）、前年春に知己となったシモン・フレキスナー博士の引き合いでアメリカに渡り、以降国際的な活躍を果たす野口英世ですが、横浜検疫所での実績は彼の躍進への第一歩であったと言えましょう。